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Die BAL, eine sinnvolle diagnostische Ergänzung bei
Atemwegserkrankungen des Pferdes
Od.
Die BAL – eine sensible ergänzende Untersuchungsmethode bei
Atemwegserkrankungen der Pferde
Bei der Untersuchung von Atemwegserkrankungen des Pferdes stehen dem
Praktiker mittlerweile etliche ergänzende Untersuchungsmethoden zur
Verfügung. Nach Aufnahme eines umfassenden Vorberichtes über
Symptomatik, Haltung, Fütterung, Leistungsbereitschaft und einer eingehenden
klinischen Untersuchung können weitergehende Untersuchungen wie
Bronchoskopie, Röntgen, Ultraschall, Blutgasanalyse, BAL (bronchoalveoläre
Lavage), TBS (Tracheobronchialsekret)und Lungenfunktionsprüfungen
durchgeführt werden. Einige der genannten Methoden sind jedoch nur mit einem
gewissen technischen Aufwand und oft auch nicht im Stall durchführbar.
Außerdem können mit einigen Methoden geringgradige Veränderungen nicht
dargestellt werden (Mair EVE 2000, 12). Das Erkennen von klinisch manifesten
respiratorischen Erkrankungen bereitet in der Regel keine Schwierigkeiten.
Subklinische Erkrankungen sind jedoch nicht immer einfach zu erfassen und
machen Spezialuntersuchungen wie Bronchoskopie und BAL
notwendig.(Stämpfli, Boehringer Dialog 2000) Die bronchoalveoläre Lavage
(BAL) ist eine leicht durchzuführende, ergänzende und sensible
Untersuchungsmethode (Hoffmann, EVE 1999, 11,6) und kann sowohl in der
Klinik als auch im Stall entnommen werden. Sie kann blind oder unter
endoskopischer Sichtkontrolle durchgeführt werden.
Die BAL ermöglicht die Gewinnung einer Zellpopulation, die insbesondere aus
kleinen Bronchien und Alveolen stammt. Sie liefert einen Überblick über den
Status der betroffenen Gewebe und kann damit als sensible Methode zur Erfas-
sung von entzündlichen Veränderungen an den Schleimhäuten der kleinen
Atemwege und eingeschränkt auch der Alveolen bewertet werden.
Technik der BAL
Die Entnahme sollte mit einem speziellen BAL-Katheter (z.B. Fa. Cook)
erfolgen. Der BAL-Katheter besteht aus Silikon und hat einen Durchmesser von
10 mm. Ein an seiner Spitze lokalisierter, aufblasbarer Ballon sorgt dafür, dass
die instillierte Flüssigkeit nicht zurückfliessen kann. Ein aufgesetzter
Dreiwegehahn ermöglicht ein leichtes Instillieren und Aspirieren der
Kochsalzlösung. Es ist wichtig, dass das Pferd für die BAL-Entnahme gut fixiert
ist. Eine Sedation ist auf jeden Fall empfehlenswert. Einige Autoren verwenden
bei Pferden mit stark reaktiven Luftwegen Bronchodilatatoren (Clenbuterol 0,8
mikrog./kg i.v. oder p.o., Albuterol als Aerosol (450 mikrog.) oder Amino-
phyllin 1mg/kg verdünnt in 500ml 0,9% NaCl), um eine Bronchokonstriktion zu
vermeiden (Stämpfli und Hoffmann). Um Unruhe und Husten auszuschalten
wird eine Lidocainlösung instilliert (150ml, 0,5%, auf 37°C erwärmt). Unter
endoskopischer Sichtkontrolle wird diese über einen Katheter im Arbeitskanal
beim Einführen des Endoskopes gespritzt. Je nach Verhalten des Pferdes und
nach Bedarf kann dies schon beim Passieren der oberen Atemwege erfolgen. Die
Carina und auch tiefere Bronchienaufzweigungen werden auf jeden Fall damit
besprüht. Bei blindem Einführen des BAL-Katheters wird die Lidocainlösung
direkt über den Katheter versprüht. Trotz Sedation und Einsatzes von Lidocain
ist bei einigen Pferden die Anwendung einer Nasenbremse notwendig.
Der BAL-Katheter wird über den unteren Nasengang eingeführt bis der
Kelhkopf erreicht ist. Der Kopf sollte in eine gestreckte Position gebracht
werden, so dass der Katheter leicht in die Trachea gleiten kann. Bei Einsatz
eines Endoskopes erfordert es manchmal etwas Geduld, den BAL-Katheter am
Endoskop vorbei in die Trachea vorzuschieben, besonders bei kleineren Pferden.
Ein nicht feststellbarer Widerstandes, das Fehlen von Schluckbewegungen und
das Aspirieren von Luft bestätigen den richtigen Sitz des Katheters in der
Trachea (Hoffmann xxxx). Da der Katheter aus Silikon und damit biegsam ist,
muß man darauf achten, dass er sich nicht im Nasopharnynx aufrollt. Die Pferde
reagieren in einem solchen Fall mit Unruhe und Husten. Aber auch beim
richtigen Sitz des Katheters in der Luftröhre können einige Pferde heftige
Hustenstöße auftreten. Dabei kann sich der Katheter umbiegen und wird
dadurch in die Maulhöhle hochgehustet. In der Regel endet es damit, dass das
Pferd das Katheterende völlig zerkaut. Es lohnt sich also, in solch einem Fall
lieber den Katheter schnell zu entfernen, das Pferd sich einen Augenblick
beruhigen zu lassen und dann neu zu beginnen. Der Katheter wird nach der
Passage der Trachea sachte weiter in die Bronchien vorgeschoben, bis man
einen leichten Widerstand spürt. Jetzt wird der Ballon mit einer 10ml Spritze mit
Luft aufgeblasen, um den sicheren Sitz des Katheters zu gewährleisten und ein
Zurückfliessen der Flüssigkeit zu vermeiden. Am Kopf wird der Katheter gegen
das Nasenseptum gedrückt, um auch hier einen sicheren Sitz zu erreichen.
Anschließend können 500ml einer auf 37°C vorgewärmten sterilen NaCl-
Lösung mittels eines Infusionsbesteckes an den Dreiwegehahn angeschlossen
werden. Ein Doppelgebläse wird mittels aufgesetzter Braunüle in die Koch-
salzflasche gesteckt. Danach werden zunächst 200-250ml Kochsalzlösung mit
leichtem Druck instilliert. Die Kochsalzlösung kann auch mittels vorbereiteter
50ml Spritzen instilliert werden. Diese werden dann auch zur Aspiration
genutzt. Die Rückgewinnung muß vorsichtig erfolgen, um keinen zu hohen
Unterdruck entstehen zu lassen. Dieser könnte zu einem Kollaps des Bronchus
und zu mechanischen Reizungen der Bronchialschleimhaut führen (Stämpfli,
Hoffmann xxx). Bei der beschriebenen Vorgehensweise lassen sich als
Minimum etwa 50-70ml der Spülflüssigkeit zurückgewinnen. In der Regel erhält
man sogar 60-80% der instillierten Flüssigkeit zurück. Unter Klinikbedingungen
werden zur Erhöhung der Zellausbeute meist zweimal ca. 250ml instilliert und
wie beschrieben rückgewonnen. Beide Chargen werden anschließend gemischt,
in 5-10ml große Röhrchen abgefüllt und zentrifugiert (10 min bei 600 - 800 g).
Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig abgekippt (dekantiert),das Sediment resuspendiert, auf drei bis vier Objektträger aufgebracht (proPräparat etwa 0,2ml; entspricht einem großen Tropfen) und jeweils über diegesamte Objektträgerfläche ausgestrichen. Dafür werden am besten Objektträgermit seitlichem Mattschliff verwandt, da man diese einfach mit einem Bleistiftauch Färbungsstabil beschriften kann. Anschließend müssen die Präparate,insbesondere wenn sie in Transportcontainern verschickt werden sollen,vollständig an der Luft getrocknet werden. Zur Beschleunig der Trocknung kanndabei ein Fön eingesetzt werden. Die Anreicherung, d.h. eine Zentrifugation derBAL vor dem Ausstreichen ist zwingend erforderlich. Direkt ausgestricheneBAL-Präparate enthalten fast immer zuwenig Zellen und eignen sich deshalbnicht für eine Auswertung. Bei einer BAL-Entnahme unter Klinikbedingungensollte angestrebt werden, die Nachbearbeitung des Material bis zur Präparat-herstellung in etwa einer Stunde abzuschließen. Der Angabe von Pickles(WEAS 2001), dass eine bei Raumtemperatur gelagerte BAL-Flüssigkeitinnerhalb von 8 Std. bearbeitet werden kann, soll an dieser Stelle aufgrundlangjähriger Erfahrungen ausdrücklich widersprochen werden. Besonders instark leukozytenhaltigen Proben kommt es sehr schnell zu einer Freisetzunglysosomaler Enzyme und damit zu einer Selbstverdauung der Zellen und auchzu einer Degradation der Entzündungs- und Schleimanteile. Wenn ausnahms-weise die weitere Bearbeitung der Lavage erst später durchgeführt werden kann,muß die Probe im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bei Lagerung derLavageprobe bis zum nächsten Tag kommt es auch bei einer Temperatur von+4°C zu einer bereits deutlichen Schädigung der Zellen die dazu führt, dassbeim Zentrifugieren und beim Ausstreichen ein großer Teil der Zellen starkbeschädigt wird. Eine im Feld entnommene Probe sollte immer schnellstmöglichzur weiteren Verarbeitung in die Praxis gebracht werden. Eine Transport ineinem mit Eis bestückten Isoliergefäß ist dabei die beste Lösung. Da es bei einerBAL-Entnahme zu Gewebsreaktionen kommen kann, sollte eine Wiederholungnicht vor Ablauf einer Woche durchgeführt werden (Deegen, Boehringer Dialog2000).
Die Erfahrungen bei der Auswertung von BAL-Proben haben gezeigt, dass dieBAL-Beurteilungen am besten von Zytologen oder Pathologen durchgeführtwerden. Der Grund dafür ist, dass für die Zellerkennung und die Beurteilung derkomlexen Schleimhautreaktionen umfangreiche Spezialkenntnisse und Erfahr-ungen auf dem Gebiet der Bronchial- und Lungenzytologie erforderlich sind.
Dies schließt prinzipiell eine Beurteilung solcher Präparate durch in derPferdepraxis tätige Kolleginnen und Kollegen nicht aus. Wer sich aber aufdieses Feld begibt sollte wissen, dass eine lange und meist auch mühseligeEinarbeitungszeit erforderlich ist, bevor aus einem "Nichtzytologen" ein "BAL-Diagnostiker" wird. Meist scheitert die Qualifizierung daran, dass Proben in Kliniken oder Praxen nicht kontinuierlich und in ausreichender Anzahl zurVerfügung stehen und Vergleiche, d.h. Präparate mit Standartkrankheitsbildernfehlen.
Für die zytologische Auswertung von BAL-Proben sind aus der Sicht desZytologen in erster Linie ein ausreichender Zellgehalt und die morphologischeUnversehrtheit der ausgestrichenen Zellen die wichtigsten Voraussetzungen.
Wenn diese erfüllt sind, können die in der Lavage enthaltenen Zellen alleindurch Anwendung zytologischer Beurteilungskriterien zu etwa 80–90%differenziert und damit auch zytogenetisch zugeordnet werden.
Anhand der erhobenen Befunde sind weitreichende Aussagen über die imbrochioalveolären Raum ablaufenden Zell- und Gewebsveränderungen möglich.
Sie liefern bei den meisten Krankheitsbildern außerdem Hinweise für die einzu-leitenden Behandlungsmaßnahmen. Die BAL-Zytologie wird deshalb beimPferd zunehmend bei der Diagnostik respiratorischer Erkrankungen eingesetzt.
Es soll aber nicht verschwiegen werden, dass bei der Entnahme einer BAL,insbesondere aber bei der Nachbearbeitung des Probenmaterials Fehler auftretenkönnen, die die Auswertung beeinträchtigen oder sogar verhindern.
Insbesondere wenn mit BAL Entnahmen begonnen wird und Erfahrungen beiden Klinik- bzw. Praxismitarbeitern noch nicht vorliegen, treten solche Fehlergehäuft auf. Wir raten deshalb, dass insbesondere in der Anfangszeit sichdiejenigen Kollegen, die für die Entnahme verantwortlich sind, mit den Zyto-logen direkt in Verbindung setzen um auftretende Mängel zu besprechen.
Dadurch gelingt es meist schnell die vorhandenen Fehler auszumerzen.
Die bei einem nicht unerheblichen Teil der zur Untersuchung übersandtenPräparate trotzdem auftretenden Mängel entsehen in erster Linie dadurch, dassAnweisungen oder Arbeitschritte nicht eingehalten oder in abweichender Formdurchgeführt werden. Nachstehend werden deshalb die am häufigstenauftretenden Fehler kurz zusammengefasst besprochen :1.) Die Zellen auf den Ausstrichen sind stark beschädigt (Zytolyse), außerdemist eine erhebliche Vermehrung bakterieller Erreger eingetreten.
Die Spülflüssigkeit wurde bei zu hohen Temperaturen, d.h. bei Raumtemperaturoder im warmen Auto längere Zeit gelagert bzw. transportiert. Insbesondere beiungekühltem Probentransport im Auto, bei der die Probenflüssigkeit außerdembewegt wird, entstehen Zellschäden. Lavage-Material sollte deshalb, wenn dieStandzeit mehr als eine Stunde beträgt, immer im Kühlschrank gelagert bzw. inThermogefäßen im Auto transportiert werden.
2.) Auf den Ausstrichen befinden sich kaum Zellen.
Lavage-Flüssigkeit wurde ohne vorherige Anreicherung direkt ausgestrichen.
Nur wenn durch Zentrifugation eine Volumeneinengung von etwa 1: 50 odernoch stärker erreicht wird, enthalten die Ausstriche genügend Zellen.
Aber auch bei zentrifugierten Proben sind häufig sehr wenig Zellen nachzu-weisen. Dafür sind in erster Linie zwei Fehler verantwortlich.
a ) Wenn die BAL bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank längere Zeitaufbewahrt wird, kommt es bereits zu einer spontanen Sedimentation der Zellen.
Schon nach etwa 20 Minuten sind in einer wässrigen Salzlösung der größte Teilder Zellen auf den Boden abgesunken. Deshalb muß vor Abfüllung der Zell-suspension in die Zentrifugenröhrchen das Vorratsgefäß vorsichtig geschütteltoder der Inhalt mit der Pipette gerührt werden. Ein großer Anteil von Präparatenmit zu niedrigem Zellgehalt entsteht dadurch, das für die Zentrifugation alleinoberflächennahe Flüssigkeitsmengen mit der Pipette abgesaugt werden, diekaum noch Zellen enthalten.
b ) Ein ähnlicher Fehler kann auftreten, wenn die gewählte Umdrehungszahloder die Zentrifugationszeit nicht eingehalten werden. Besonders Proben mitschleimig-viskösen Sekretverdichtungen zeigen eine verzögerte Sedimentation.
Das dadurch lockere Bodensediment wird beim Abgießen des Überstandesleicht mit entfernt, d.h. die Zellen befinden sich danach nicht mehr amRöhrchenboden sonders sind im Abfallgefäß bzw. im Ausguß gelandet. JedesKlinik-oder Praxislabor sollte deshalb mit geeignetem Übungsmaterial diesePräparationsschritte einüben bevor diagnostisch relevantes Material bearbeitetwird.
c ) Die Unsicherheit beim Dekantieren führt dazu, dass versucht wird denÜberstand mit der Pipette abzusaugen. Dabei wird das Sediment zumindest zugroßen Anteilen aufgewirbelt, sodass die Zellen bei dieser Methode ebenfallsverloren gehen.
Für eine ausreichende Anreicherung der Zellen ist deshalb die Einhaltung derangegebenen Zentrifugationsbedingungen besonders wichtig. Nur bei einemausreichend verdichtetem Sediment kann der Überstand ohne Materialverlustdekantiert werden. Zum Resuspendieren reichen dabei meist die an der innerenRöhrchenwand haftenden Flüssigkeitsmengen. Wenn die Zentrifugenröhrchennach dem Dekantieren wieder senkrecht gestellt werden, kann so das Zell-material am Boden einfach resuspendiert werden. Bei solchem Vorgehenkönnen leicht Volumeneinengungen von 1 . 50 bis sogar 1 . 100 erreicht werden.
3. ) Fehler beim Herstellen und beim Versand der Ausstriche.
Die resuspendierte Zellsuspension sollte mit einer Pipette oder mit einemRöhrchen auf die Objektträger übertragen werden. Der häufigste Fehler dabeiist, dass das Probenmaterial in zu großer Menge aufgetragen wird. Für gutezytologische Präparate muß die Zellsuspension in dünner Schicht eintrocknen.
Nur so spreizen sich die Zellen beim Trocknen ausreichend, so daß sie nach demAnfärben eine dünne Schicht bilden, in der Kern- und auch Zytoplasmastruk-turen gut erkennbar sind. Bei größerer Schichtdicke bleiben die Zellen meistkugelförmig und färben sich dadurch mit den verwendeten Farbstoffen sehr vielstärker an. Sie sind deshalb nur als überfärbte Farbstoffhaufen erkennbar.
Deshalb muß die Zellsuspension, auch wenn sich darin visköse oder fockige Verdichtungen befinden, wie ein Blutausstrich über die gesamte Präparatflächeausgestrichen werden. Für die anschließende Lufttrocknung kann zur Zeiter-sparnis ein Fön verwendet werden. Für die Qualität der Zelldarstellung ist auchdas zügige Trocknen der Präparate wichtig, da bei langsamem Wasserverlustsich noch Veränderungen der Zellmorpholie ausbilden, die eine Differenzierungerschweren können. Insbesondere bei hoher Luftfeuchtigkeit sollte die Trock-nung deshalb entweder mit einem Fön oder im Brutschrank durchgeführtwerden. Bei längere Zeit feuchten Präparate fallen außerdem die Färbungendeutlich schlechter aus. Außerdem besteht bei feucht bleibenden Präparaten dieGefahr, dass sich vorhandene Bakterien weiter vermehren.
Dieses Problem ist insbesondere beim Versand von Ausstrichen von großerBedeutung. Wenn die Ausstriche in noch feuchtem Zustand in die gut schließen-den Transportcontainer verbracht werden, wird die weitere Trocknung unter-brochen. Während des meist ein- oder zweitägigen Transportes vermehren sichdie zunächst wenigen Bakterien so stark, dass die gesamten Ausstrichflächenüberwuchert werden, d.h. nach Beendigung des Transportes mit zusammen-hängenden Bakterienkolonien bedeckt sind. Die von den Erregern abgegebenenEnzymen verursachen dabei eine lytische Beschädigung der Zellstrukturen oderführen sogar im Zentrum der Kolonien zur vollständigen Auflösung. Deshalb istwichtig, dass nur vollständig getrocknete Präparate versandt werden. Mitdiesereinfachen Maßnahme kann die Bakterienvermehrung sicher unterbundenwerden.
Beim Versenden von Ausstrichen sollte außerdem beachtet werden, dass diebenutzten Transportcontainer gut verschlossen werden. Rausgerutschte Objekt-träger werden auf den automatischen Sortierstraßen der Post fast immer zerstört.
Auch ein Versand in Papier eingewickelter Präparate führt fast immer zumtotalen Glasbruch. Weiterhin zeigen Erfahrungen, dass Transportcontainer die inPapierbriefumschlägen versandt werden, durch die Rollen auf den Transport-und Sortiereinrichtungen fast immer aus den Umschlägen herausgedrücktwerden. Für den Versand von Proben sollten deshalb ausschließlich die einge-führten Kunststoffbeutel Verwendung finden.
Wenn aus technischen Gründen eine Anreicherung der Zellen in der Lavagedurch Zentrifugation nicht möglich sein sollte, kann ausnahmsweise ein Teil derzurückgewonnenen Spülflüssigkeit an das Untersuchungslabor auch direktversandt werden. Dafür sind etwa 50 ml von der vorhandenen Lavage aus-reichend (beim Abfüllen vorher schütteln !). Auch 10ml reichen notfalls aus.
Die Zellsuspension sollte dabei aber nicht nativ sondern in konserviertemZustand versandt werden. In unfixiertem Zustand kommt es insbesondere beihohen Außentemperaturen zu der bereits besprochenen mehr oder wenigervollständigen enzymatischen Auflösung der Zellen und zur bakteriellenÜberwucherung. Eine ausreichende Konservierung der Zellen und eine Unterdrückung der Bakterienwachstums erreicht man schon durch Zugabe vonwenig Formalin-Lösung ( Volumenanteil etwa 1 : 20 bei Verwendung einer 5 –10%igen Formalinlösung). Höhere Formalinzusätze führen dagegen zu starkenQualitätseinbußen bei den gängigen panoptischen Färbungen.
Ausnahmsweise kann auch Tracheobrochiales Sekret (TBS) für eine zytolo-gische Untersuchung verwendet werden. Eine solche Situation besteht z.B. wenndie für die Entnahme notwendigen Geräte oder die Zentrifuge nicht vorhandenoder defekt sind bzw. Spülpuffer aufgebraucht ist.
Die Untersuchung von TBS hat den Nachteil, dass darin überwiegend etwasältere, d.h. vor etwas längerer Zeit aus den Schleimhäuten ausgetreteneZellenenthalten sind. Da aber mit dem Sekretstrom, d.h durch die Kinizilen-tätigkeitdes respiratorischen Epithels ständig Zellen sowohl aus den Alveolenals auch von kleinen Bronchien bis in die Trachea transportiert werden, erhältman auch bei der Untersuchung einer solchen Sekretprobe ebenfalls einerepräsentative Auswahl der im bronchioalveolären Raum vorkommendenZellen. Die TBS-Proben haben sogar den Vorteil, dass insbesondere die interminalen Bronchien und Alveolen desquamierten Zellen und auch ausgetre-tene Sekretbestandteile wie Fibrin oder kondensierte Schleimprodukte ihrentopographischen Zusammenhalt weitgehend beibehalten. Dies bedeutet, dassinsbesondere Verlegungen in kleinen Bronchien durch Entzündungsprodukte,verdichtete Schleimsubstanzen oder flächig desquamierte Epithelien bessererkennbar sind. Bei der BAL werden dagegen die nichtzellulären Entzündungs-produkte in der Spüllösung feinverteilt suspendiert oder gelöst. Sie entziehensich damit einer mikroskopischen Beurteilung. Aufgrund der dargestelltenSituation sind bereits mehrere größere Kliniken dazu übergegangen, neben denSedimentausstrichen von der BAL zusätzlich jeweils ein oder zwei TBS-Ausstriche anzufertigen und zu übersenden. Der Untersucher hat dann für dieBeurteilung der repräsentativen Zellstichprobe aus den tieferen Atemwegen dieBAL-Präparate zur Verfügung. Die kondensierten Sekretanteile, insbesondereeiterflockenartige Zusammenlagerungen aus Fibrin und Leukozyten undverdichtetes Schleimprodukte, die insbesondere bei chronischen Brochitis-formen vermehrt vorkommen und vorrangig für die Verlegung gerade derkleinen Atemwege verantwortlich sind, können dagegen an den TBS-Präparatenbeurteilt werden.
Die BAL- und eingeschränkt auch die TBS-Diagnostik hat gegenüber anderenUntersuchungsmethoden (transtracheal, tracheobronchial) den Vorteil, dass sierecht gut standardisierbar sind. Entzündungs- und Immunzellen werden sehrsensitiv und spezifisch erfasst und dargestellt. Die einzelnen Entzündungs-formen ( z.B. akut, subakut oder bereits chronisch; Fibrin- und Schleimgehalt des Sekretes) können differenziert beurteilteilt werden und ermöglich gezielteHinweise für die einzuleitende Therapien. Besonders die Menge und der Funk-tionszustand der im Sekret vorkommenden Immunzellen und Makrophagensowie die Regenerationsintensität des Epithels in terminalen Bronchie undAlveolen ermöglichen Rückschlüsse über Krankheitsstadien gerade bei COBPatienten. Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet sind Ankaufsunter-suchungen. Hier ist die Zellanalyse eine wichtige Grundlage mit der latente oderchronische respiratorische Erkrankungen sicherer erfasst werden können.

Source: http://www.praxisfuertierpathologie.de/pdf/methodiktracheobronchialsekret.pdf